چنانچه در خصوص فعالیتهای شرکت و یا محصولات و خدمات شرکت سوالی دارید، می توانید نسبت به بررسی موارد زیر اقدام نمایید. چنانچه پاسخ خود را دریافت ننمودید، با ما تماس بگیرید!

برای قویتر شدن محصول PCR چه راه حلی توصیه می گردد؟

  • دماي اتصال را تا جاي ممكن كم كنيم (بتدريج بصورت گراديانت)
  • پرايمر زياد شود.
  • الگو زياد شود.
  • آنزيم زياد شود.
  • غلضت kclتغيير كند. (براي محصولات بيشتر از ۱۰۰۰باز بيشتر شود و براي محصولات كمتر از ۱۰۰۰ كمتر شود.)
  • ادجوانت اضافه شود (۰/۸ -۰/۱ mg/µlدر غلظت نهايي و يا ۰/۵ DMSO و يا گليسرول)
  • به طول پرايمر ۵ نوكلئوتيد اضافه گردد.

دستگاه PCR پیش از این کار میکرد، اما الان خوب کار نمی کند. چه باید کرد؟

  • دقت شود تا همه اجزاء اضافه شده باشد.
  • باید DNTP عوض شود ( زيرا به آب شدن حساس است بخصوص در Multiplex)
  • پرايمر زياد شود
  • الگو زياد شود
  • دماي اتصال ۴-۱۰ درجه كاهش يابد.

برای حل مشکل ناشی از رزولوشن ضعیف باندها در تکنیک SDS-PAGE چه باید کرد؟

  • غلظت پروتئین خیلی بالاست (کاهش غلظت پروتئین)
  • میزان حجم نمونه خیلی زیاد است (افزایش غلظت پروتئین)
    غلظت ژل مناسب نیست (اگر سایز پروتئین ناشناخته است، بهتر است از ژل گرادیان ۲۰%-۴% استفاده شود)
  • ژل اکریل امید کهنه و قدیمی است (ساخت مجدد ژل یا استفاده از ژل های پیش آماده)
  • مازاد تشکیل میسل (نمونه از ۲۰۰µg SDS / 30µl بیشتر نشود)
  • به علت رقت زیاد بافر، سرعت ران شدن ژل بالاست (افزایش غلظت بافر)
  • به علت جریان بالا ، سرعت ران شدن ژل بالاست (کاهش ولتاژ تا حدود %۵۰-۲۵)
  • باندهای پروتئین به اندازه کافی در ژل حل نشده اند (سایز منافذ ژل برای جداسازی مناسب نیست بنابراین باید از ژل اکریل امید با درصدی متفاوت استفاده شود)

برای حل مشکل ناشی از ران شدن غیرمستقیم باندها در الکتروفورز افقی چه باید کرد؟

  • ژل به صورت یکنواخت در تانک ریخته نشده است.
  • تانک الکتروفورز درمحل مسطح قرار داده نشده است.
  • بافر به میزان کافی در تانک ریخته نشده است.
  • بافر سیالیت لازم را ندارد.
  • دمای بافر حین ران شدن، دستخوش نوسان شده است.
  • الکترودها دچار شکستگی شده اند.
  • تانک الکتروفورز یا پاور ساپلای نیاز به سرویس دارند.

برای حل حل مشکلات احتمالی در حین انجام تکنیک SEMI DRYچه باید کرد؟

  • زمان انتقال کم می باشد.بهتر است که زمان انتقال را زیاد کرد.
  • نسبت بار به جرم غلط می باشد. پروتئین ها نزدیک به نقطه ایزوالکتریک خود در PH بافر دارای انتقال ضعیف می­باشند. برای رفع این موضوع بهتر است به منظور افزایش انتقال پروتئین ها از بافر دارای خواص اسیدی و یا قلیایی قوی تر استفاده کرد.
  • کاغذ صافی بسیار خشک می­باشد. یا کاغذ در بافر کم و ناکافی خیس خورده است. یا در همان ابتدای عمل انتقال بافر خشک شده است. بهتر است که قبل از عمل انتقال کاغذ صافی کاملا در بافر خیسانده شود. تعداد صفحات کاغذ صافی را افزایش دهید، و یا از یک کاغذ صافی ضخیم تر استفاده کنید.
  • جریان پاور افت می کند. فیوزهای آن را بررسی نمایید.
  • درصد ژل خیلی زیاد می­باشد. T (جمع مونومرها) و یا C (کراس لینکر ها) را کاهش دهید. در C به مقدار ۵% کوچکترین اندازه منافذ تولید می شود. با کاهش از این مقدار، اندازه منافذ بزرگتر خواهد شد و کیفیت انتقال بهتر خواهد شد.
  • متانول موجود در بافر،موجب محدودیت عمل شستشوی پروتئین ها از ژل می شود. خارج نمودن متانول کیفیت انتقال بهتر خواهد شد، اما این عمل همچنین سبب کاهش اتصال به نیتروسلولز خواهد شد. از PVDF استفاده کنید.
  • پروتئین در ژل رسوب کرده است. سعی کنید از SDS در بافر انتقالی استفاده کنید. SDS می­تواند کیفیت انتقال را بهتر کند، اما می­تواند کیفیت اتصال به نیتروسلولز را کاهش دهد و نیز واکنش پذیری بعضی پروتئین ها با آنتی­بادی­ها را کم کند.
  • تماس بین غشای بلات و ژل ضعیف می باشد. حباب های هوا یا رطوبت اضافه بین بلات و ژل قرار می گیرد. با استفاده از پیپت با دقت آن را روی کاغذ صافی به دو جهت غلط دهید تا رطوبت اضافه و حباب های هوا بین ژل و غشا بیرون بروند و تماس کامل حاصل شود. از یک کاغذ صافی ضخیم تر در ساندویچ ژل/غشا استفاده کنید. مطمئن شوید که هیچ گونه حبابی بین کاغذ صافی و ژل موجود نمی باشد.
  • ژل کاملا در بافر انتقالی به تعادل نرسیده است. ژل باید در بافر انتقالی کاملا شسته شود تا از چروکیده شدن یا تورم آن در زمان انتقال جلوگیری شود. مدت زمان شستشو و یا تعداد دفعات شستشو را افزایش دهید.
  • اگر چندین ژل همزمان در حال انتقال می باشند، ممکن است آلودگی متقاطع رخ دهد. برای رفع این مشکل از کیسه دیالیز دارای منافذ کوچکتر استفاده شود تا ساندویچ های ژل/غشا را از هم جدا کند. یا از کاغذ PVDF استفاده کنید تا با کیفیت بالاتری به قطعات کوچک متصل شوند.
  • توان اعمال شده به سیستم انتقالی بالا می باشد. ولتاژ را کاهش دهید. هدایت پذیری بافر را بررسی نمایید. بافری که بدرستی تهیه نشده است موجب اعمال توان اضافی به سیستم انتقالی می شود.

اتصال ضعیف به غشای نیتروسلولز

  • جهت انتقال در شرایط بهینه اتصال، پروتئین های جداشده توسط SDS-PAGE نیازمند متانول ۲۰ ٪ هستند. مطمئن شوید که بافر حاوی میزان کافی از متانول می باشد.
  • پروتئین های بزرگتر از ۱۵ کیلودالتون ممکن است به طور ضعیفی به نیتروسلولز ۰٫۴۵ میکرونی متصل شوند و یا در هنگام آزمون از غشا شسته شوند. بهتر است در اینجا از غشای نیتروسلولزی ۰٫۲ میکرون استفاده شود. می­توان جهت بهبود اتصال، پروتئین ها را با گلوتارآلدهید کراس لینک داد.
  • پروتئین ها را می­توان با SDS، NP-40 و چندین دترجنت دیگر از غشای نیتروسلولز جدا کرد. از دترجنت توین-۲۰ در شستشو و مراحل انکوبه نمودن با آنتی بادی استفاده شود. دترجنت ها را در بافر کامل خارج نمایید و یا میزانشان را کم نمایید. از فیکساسیون با گلوتارآلدهید استفاده شود.
  • SDS موجود در بافرهای انتقالی موجب کاهش کیفیت اتصال پروتئین ها می شود. از متانول ۲۰ ٪ در بافر انتقالی استفاده شود و قبل از انتقال ژل را در بافر متانول به تعادل برسانید.

حساسیت کم تشخیص و یا واکنش پذیری کم

  • راهنمای استفاده کیت بررسی شود.
  • اتصال آنتی ژن ناقص است.
  • زمان های واکنش آنتی­بادی کافی نمی­باشند. زمان های واکنش افزایش یابند.
  • بارگیری نمونه کافی نیست. غلظت پروتئین برده شده بر روی ژل را افزایش دهید.
  • ممکن است به منظور جلوگیری از دناتوره شدن در زمان انتقال، آنتی ژن نیازمند تنظیمات دمایی خاصی باشد. دستگاه های انتقالی تر ساخت دنا ژن تجهیز دارای سیرکولاتور می باشند، بنابراین بهتر است از این نوع انتقال استفاده شود.
  • آنتی­بادی­های مونوکلونال ممکن است آنتی­ژن دناتوره شده را شناسایی نکنند. اتصال آنتی­بادی­های مونوکلونال و یا پلی کلونال دیگر را بررسی نمایید. پروتئین های نیتیو را بلات نمایید.

جهت رفع اشکال در حین انجام تکنیک الکتروفورز عمودی چه باید کرد؟

در ذیل لیستی از مشکلات احتمالی تکنیک الکتروفورز پروتئین آمده است که توضیحات آن نیز در کنار هر کدام ذکر شده است.

 

  1. مشکل:‌عدم پلیمریزاسیون یا پلیمریزاسیون ناقص ژل

علت: پایین بودن دمای محلول ها

رفع مشکل:‌قبل از استفاده لازم است دمای محلول ها به دمای محیط برسد (۲۰-۳۰ درجه سانتیگراد)

علت: کهنگی یا کم بودن مقدار کاتالیزورها مخصوصا پرسولفات آمونیوم

رفع مشکل: محلول تازه پرسولفات آمونیوم تهیه گردد. مقداری بیشتری پرسولفات آمونیوم به محلول ژل اضافه گردد.

علت:‌کهنه بودن محلول استوک اکریل آمید

رفع مشکل:‌محلول تازه اکریل آمید تهیه شود.

علت:‌اثر اکسیژن هوا به خصوص در محلول های سرد

رفع مشکل:‌دمای محلول ها به دمای محیط برسد. محلول ژل هواگیری شود.

علت:‌غلظت بالای ماده احیا کننده ۲-مرکاپتواتانول در ژل

رفع مشکل:‌در صورت امکان ۲-ME را در غلظت کم به ژل اضافه کنید یا آن را در محلول ژل وارد نسازید.

  1. مشکل:‌منعقد نشدن بخشی از ژل اکریل آمید در قالب شیشه ای

علت:‌مخلوط نشدن پرسولفات آمونیوم در محلول ژل مخصوصا در ژل های غلیظ

رفع مشکل:‌بعد از افزودن پر سولفات آمونیوم به محلول ژل، آن را کاملا مخلوط کنید.

  1. مشکل: جدا شدن ژل از شیشه یا طلق های قابل اتصال به ژل

علت:‌ کثیف بودن سطح شیشه

رفع مشکل:‌سطح شیشه را کاملا تمیز نمایید.

علت: انعقاد ژل روی سطح آبگریز طلق یا کهنه بودن آن

رفع مشکل:‌سطح آبدوست طلق به طرف ژل قرار گیرد. از طلق تازه استفاده شود.

  1. مشکل:‌چروکیده شدن ژل

علت:‌ گرمای زیاد حاصل از پلیمریزاسیون در ژل های با درصد بالا

رفع مشکل:‌ محلول ها خنک گردد. سرعت پلیمریزاسیون با تغییر مقدار پرسولفات آمونیوم کنترل شود.

علت:‌گرمای زیاد در هنگام الکتروفورز به دلیل مقاومت الکتریکی.

رفع مشکل: الکتروفورز در جریان الکتریکی کمتر و در مدت طولانی تری صورت گیرد.

علت:‌بالا بودن ضخامت ژل یا درصد ژل در هنگام خشک کردن یا قطع جریان برق در هنگام خشک شدن ژل در دستگاه خشک کن

رفع مشکل:‌قبل از خشک کردن، ژل را نیم ساعت در محلول حاوی متانول ۲۰-۳۰  درصد و گلیسرول ۳ درصد قرار دهید.

  1. مشکل:‌چاهک های نامنظم و ناقص در ژل بالا (Stacking gel)

علت: احتباس هوا در انتها یا کناره دندانه های شانه

رفع مشکل: شانه را خارج ساخته ، مجددا در محل خود قرار دهید، به نحوی که حباب هوا نداشته باشد.

علت: خارج ساختن شانه قبل از کامل شدن انعقاد ژل بالا

رفع مشکل:‌پس از اطمینان از انعقاد ژل بالا، شانه را خارج نمایید، چاهک ها را با بافر الکترود بشویید.

  1. مشکل:‌حرکت بیشتر رنگ نشانگر در بخش میانی ژل

علت:‌بالا بودن دمای بخش میانی به دلیل تبادل حرارتی کمتر با محیط

رفع مشکل:‌برای تبادل حرارتی یکسان از سیستم سیرکولاتور استفاده شود. در غیر این صورت در ولتاژ یا توان پایین کار کنید.

  1. مشکل:‌وجود باند قوی در ابتدای ژل جدا کننده

علت:‌وجود تجمعات بزرگ و نامحلول پروتئین یا لیپوپروتئین در نمونه (مخصوصا در PAGE)

رفع مشکل:‌ نمونه را قبل از الکتروفورز ۱۵ دقیقه در ۲۰/۰۰۰xg سانتریفیوژ نمایید. الکتروفورز را در حضور مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین ها انجام دهید.

علت: وجود ژل متراکم کننده (معمولا در page)

رفع مشکل:‌در سیستم بافری پیوسته الکتروفورز را انجام دهید.

علت: بالا بودن درصد ژل نسبت به وزن مولکولی عده ای از پروتئین های موجود در نمونه

رفع مشکل:‌در صورت امکان درصد ژل را پایین آورید، یا الکتروفورز را در ژل با شیب غلظت انجام دهید.

علت:‌کاهش غلظت SDS یا ماده احیا کننده در SDS-PAGE

رفع مشکل:‌غلظت SDS یا ماده احیا کننده  در بافر نمونه را افزایش دهید یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

علت: پایین بودن PH نمونه (بخصوص بعد از رسوب با تری کلرو استیک اسید)

رفع مشکل:‌PH نمونه را تنظیم کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز کنید. قبل از الکتروفورز، نمونه را در ۲۰/۰۰۰xg سانتریفیوژ نمایید.

  1. مشکل:‌قرار نگرفتن نمونه در ته چاهک ها

علت: عدم وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه

رفع مشکل: به بافر  نمونه گلیسرول یا ساکارز اضافه شود.

  1. مشکل: جاری شدن نمونه در چاهک های کناری

علت:‌بزرگتر بودن ضخامت اسپیسر ها نسبت به ضخامت شانه

رفع مشکل:‌در هنگام تهیه ژل از شانه مناسب استفاده شود.

علت:‌سرریز شدن چاهک ها از نمونه

رفع مشکل:‌حدود ۳۰-۵۰ درصد هر چاهک از نمونه پروتئینی بریزید.

  1. مشکل:‌باندهای نامنظم و مواج

علت:‌ وجود حباب های هوا در ژل

رفع مشکل:‌محلول ژل را هواگیری نمایید.

علت: ناهمگونی اندازه منافذ ژل

رفع مشکل: محلول ژل را کاملا مخلوط نمایید. مقدار پرسولفات آمونیوم را تنظیم نمایید تا زمان انعقاد ژل متناسب گردد.

علت: لرزش قالب شیشه ای در هنگام انعقاد ژل

رفع مشکل:‌قالب شیشه ای را فیکس نموده و آن را کنار دستگاه های لرزاننده قرار ندهید.

علت: ادامه پلیمریزاسیون ژل در چاهک ها پس از خارج ساختن شانه

رفع مشکل:‌پس از انعقاد  کامل ژل بالا و خارج نمودن شانه، چاهک ها را با بافر الکترود شستشو دهید.

علت: بالا بودن غلظت نمک در نمونه

رفع مشکل: نمونه را با بافر نمونه (۱X) رقیق کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز نمایید.

علت: عدم تماس کامل ژل با نوارهای کاغذی و یا الکترودهای فلزی

رفع مشکل: لبه نوارهای کاغذی را بطور مساوی روی لبه طولی ژل قرار دهید، سپس الکترودهای فلزی را بطور دقیق روی نوارها قرار دهید.

  1. مشکل:‌ وجود ستون های رنگی با باندهای نا مشخص یا کاملا تفکیک نشده

علت:‌پروتئولیز شدید در هنگام استخراج یا آماده سازی نمونه

رفع مشکل:‌استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهار کننده های پروتئیازها صورت گیرد. بعد از افزودن بافر نمونه در SDS-PAGE نمونه را سریعا در آب جوش قرار دهید.

علت:‌پایین بودن کیفیت SDS

رفع مشکل:‌ SDS با درجه خلوص بالا تهیه شود.

علت: وجود غلظت بالای موادی مثل کلرید گوانیدیوم در نمونه

رفع مشکل:‌در صورت امکان نمونه را رقیق کنید یا کلرید گوانیدیوم را با ترکیبات سازگار در الکتروفورز (مثل اوره) تعویض کنید.

  1. مشکل: خطوط رنگی در مسیر الکتروفورز در ستون ها

علت: حل شدن تدریجی توده های مولکولی موجود در نمونه

رفع مشکل: نمونه را قبل از الکتروفورز به مدت ۱۵ دقیقه در حداقل ۲۰/۰۰۰xg سانتریفیوژ نمایید.

  1. مشکل:‌وجود باندهای کاذب در تمام ستون ها

علت: وجود باندهای کاذب در تمام ستون ها یا در سراسر عرض ژل

رفع مشکل: اثر ۲-ME پس از رنگ آمیزی ژل با نقره (به صورت دو باند منتشره در موقعیت های ۵۰ و ۶۷ کیلو دالتون)

رفع مشکل: به جای ۲-ME از دی تیوتریتول استفاده نمایید یا ژل را با روش دیگری رنگ امیزی کنید.

علت: آلوده شدن بافر نمونه

رفع مشکل: بافر تازه تهیه نمایید.

علت: وجود ناخالصی در بافر مخزن بالا

رفع مشکل:‌از مواد شیمیایی با خلوص و کیفیت بالا برای تهیه بافرها استفاده نمونه، ترجیحا از بافرها مجددا استفاده نکنید.

  1. مشکل: عدم تکرار پذیری نتایج الکتروفورز

علت: پروتئولیز نمونه در هنگام استخراج یا نگهداری آن

رفع مشکل: استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهارکننده های پروتئاز صورت گیرد. نمونه در شرایطی نگهداری شود که دچار حداقل تغییرات گردد.

علت: متناسب نبودن مقدار SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه نسبت به پروتئین (در SDS-PAGE)

رفع مشکل: غلظت SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه افزایش یابد یا در صورت امکان رقیق گردد.

علت:‌تغییر در روش یا شرایط رنگ آمیزی

رفع مشکل: ژل ها را با یک روش ثابت و در شرایط یکسان رنگ آمیزی کنید.

  1. مشکل: تبلور اوره در ژل

علت: پایین بودن درجه حرارت

رفع مشکل:‌الکتروفورز در دمای ۱۵ درجه سانتیگراد انجام شود.

  1. مشکل: رانش کاتدی پروتئین ها در ایزوالکتروفوکوسینگ

علت: حل شدن گاز کربنیک در بخش قلیایی ژل

رفع مشکل:‌محلول کاتولیت را هواگیری نموده، از NaOH با درجه خلوص بالا (دارای حداقل ناخالصی کربنات) برای تهیه آن استفاده کنید. از تماس هوا با ژل تا حد امکان خودداری شود. زمان الکتروفورز تا حد امکان کوتاه شود.

علت: الکترواسمز

رفع مشکل: استفاده از اکریل آمید با خلوص بالا در تهیه ژل جذب ترکیبات یونی آزاد با رزین های تعویض کننده یون (مثل آمبرلیت MB-6). افزودن گلیسرول به ژل در غلظت ۱۰-۱۵ درصد

جهت حل مشکلات احتمالی در حین انجام تکنیک وسترن بلات چه باید کرد؟

انتقال ضعیف پروتئین ها در بلاتینگ

دلیل:‌بالا بودن درصد ژل در الکتروفورز

حل:‌الکتروفورز در ژل نازک تر صورت گیرد.

دلیل:‌احتباس حباب های هوا در حد فاصل ژل و غشا

حل: اجزای بلات کاملا در بافر انتقال به تعادل برسند. بعد از افزودن هر لایه از مجموعه بلات حباب های هوا با لوله آزمایش (به عنوان وردنه) خارج گردد.

دلیل:‌کم بودن زمان انتقال

حل:‌ انتقال در ولتاژ پایین تر در طول شب انجام گیرد.

دلیل:‌بالا بودن درصد متانول در بافر انتقال

حل:‌ درصد متانول را به ۵-۱۰ درصد کاهش دهید.

دلیل:‌بالا بودن غلظت دترجنت ها (مثلا SDS)

حل:‌ غلظت SDS در بافر انتقال را کاهش دهید.

دلیل:‌ کاهش دانسیته بار منفی در پروتئین ها

حل:‌ بافر با PH بالاتر انتخاب گردد.مقدار کمی SDS نیز به آن اضافه گردد.

دلیل: ضعیف بودن قابلیت اتصال غشا

حل:‌ از غشای تعویض کننده یون یا غشای نایلون استفاده شود.

مشکل:‌ رنگی شدن زمینه غشا در وسترن بلات

دلیل:‌ عدم وجود توین -۲۰ در بافرهای رقیق کننده و شوینده

حل:‌ توین-۲۰ در غلظت ۱/۰-۰۵/۰ درصد به بافر اضافه گردد.

دلیلمسدودسازی ناقص (غلظت کم ماده مسدود کننده و یا زمان مسدودسازی)

حل:‌ درصد ماده مسدود کننده و یا زمان مسدودسازی افزایش یابد.

دلیل:‌ نا مناسب بودن پروتئین مسدودکننده (دارای ناخالصی های آنزیمی یا واکسن با آنتی بادی ها)

حل:‌ نوع پروتئین مسدود کننده تغییر یابد یا از دترجنت ها استفاده شود.

دلیل:‌ بالا بودن غلظت اولیه آنتی بادی اولیه و یا ثانویه (کانژوگه)

حل:‌ آنتی بادی ها در رقت های بالاتر مورد استفاده قرار می گیرند.

دلیل:‌ نا خالص بودن آنتی بادی ها و یا خراب شده کانژوگه ها

حل:‌ از انواع خالص تر آنتی بادی استفاده شود. کانژوگه تازه تهیه گردد.

دلیل:‌ ناکافی بودن مراحل شستشو و یا طولانی نشدن مدت انکوباسیون غشا در سوبسترای آنزیم

حل:‌ مراحل شستشو و بطور کامل و به دقت صورت گیرد. مرحله انکوباسیون غشا در سوبسترای آنزیم به مدت ۲۰-۵ دقیقه کافی است.

مشکل:‌ لکه ها یا نواحی سفید در بلاتینگ ممکن است در اثر گیرافتادن حباب و یا نواحی خیس نشده غشا باشند که پروتئین به آنها متصل نخواهد شد. هر دو مورد را می توان با دقت رفع نمود.

دلیل:‌ دلیل آن می تواند سر هم نمودن ناصحیح ساندویچ وسترن و یا گیر افتادن حباب هوا در آن باشد.

مشکل:‌ وجود زمینه بسیار تاریک در بلات:

دلایل:‌بلاک شدن ناقص غشا:

  • افزودن غلظت مسدود کننده
  • افزودن مدت زمان مرحله مسدود کردن
  • افزایش دمای مرحله مسدود کردن
  • استفاده از ماده مسدود کننده دیگر

آلودگی محلول مسدود کننده

راه حل:

  • ‌استفاده از یک پروتئین خالص مانند BSA یا کازئین به عنوان بلاک کننده
  • از بافرهای بلاک کننده استفاده نکنید.

انکوباسیون با سوبسترا به مدت طولانی

راه حل:‌

  • مدت زمان انکوباسیون با سوبسترای تشخیصی کم شود.

در صورتی که از ماده رنگ دار استفاده می شود، هنگامی که سطح نویز به سیگنال قابل قبول است بلات را از محلول سوبسترا بیرون آورده و در آب دیونیزه قرار دهید.

مقدار آنتی بادی زیاد است

راه حل:

  • غلظت انتی بادی اولیه و یا ثانویه را کاهش و یا تعدیل نمایید.
  • از یک تست آزمایشی دات بلات استفاده نمایید تا غلظت های آنتی بادی بهینه گردد.
  • مدت زمان انکوباسیون را کم نمایید.

مشکلات مخصوص تانک بلاتینگ

  • پروتئن بیش از اندازه بارگیری شده است.
  • مقدار پروتئین بر روی ژل را کاهش دهید.
  • غلظت SDS در بافر انتقالی را کاهش دهید.
  • یک غشای دیگر اضافه کنید تا پروتئین اضافی به آن متصل گردد.

اتصال آنتی بادی به پروتئین ها در بافر مسدود کننده:

راه حل:

  • استفاده از مواد مسدود کننده دیگر، مثلا: آلبومین، ژلاتین ، BSA ، کازئین و شیر خشک بدون چربی

در هنگام استفاده از سیستم بیوتئین- آویدین از شیر به منظور بلاک نمودن غشا ها استفاده نکنید. زیرا شیر حاوی بیوتئین می باشد.

زمان ناکافی بین گام های انکوباسیون

  • افزایش مدت زمان و تعداد گام های شستشو (حداقل ۵×۵ دقیقه)
  • از مقادیر بیشتر بافر شستشو استفاده کنید.

خشک شدن غشا در زمان گام های انکوباسیون بلاتینگ

راه حل:

  • مطمئن شوید غشا کاملا در هنگام شروع فرایند خیس شده است و نیز مطمئن شوید که بلات در هر مرحله خشک نمی شود.
  • مطمئن شوید که غشا در زمان انکوباسیون و شستشو با بافرها کاملا غوظه ور است.

از بین رفتن فعالیت آنتی بادی در اثر نگهداری بلند مدت

راه حل:

  • استفاده از آنتی بادی تازه که در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شده است.
  • در صورتی که قرار است برای مدت زمان خیلی طولانی از آنتی بادی استفاده شود، بهتر است که آن را در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری کرد و آن را به بچ های خیلی کمی تقسیم نمود.
  • از سیکل های فریز-دفریز آنتی بادی خودداری شود.

دمای انکوباسیون خیلی بالا

راه حل: استفاده از دمای انکوباسیون پایین تر

در صورتی که کاغذ PVDF دارای پس زمینه بیشتری نسبت به نیتروسلولز است، از نیتروسلولز استفاده کنید.

در صورتی که بافر آلوده است:‌

  • از بافر تازه استفاده کنید .
  • همه بافرها را قبل از استفاده با فیلتر ۲ میکرومتری فیلتر نمایید.

مشکل: پس زمینه لکه لکه

این مشکل می تواند ناشی از غشای خشک و یا شستشوی ناکافی باشد. هر دو مساله به راحتی قابل حل هستند اگر بلات را کاملا و در تمام مدت غوطه ور نگه داشت. باید در جابجایی دقت بیشتری شود تا از چنین آلودگی در آزمایشگاه ها جلوگیری شود.

نقاط ناهموار بر روی بلات و یا پس زمینه خالدار

پس زمینه خالدار و لکه ای می تواند به دلیل اتصال یک جسم خارجی به غشا، تجمع آنتی بادی، اسکنر کثیف و یا سطوح کثیف کاست های وسترن بلات باشد.

انتقال کاست های ژل بر روی بلات

دلیل مشکل:

  • استفاده از پدهای فیبری باریک و یا آلوده
  • مقادیر اضافی از پروتئین بر روی ژل بارگیری شدند و یا SDS خیلی زیادی در بافر LOADING استفاده شده است.
  • بافر انتقال آلوده است.

 

برای حل مشکلات الکتروفورز DNA چه باید کرد؟

مشکل: شدت پایین همه یا تعدادی از باندهای DNA

دلایل احتمالی:‌

  • بارگذاری مقدار کم DNA Ladder
  • رنگ آمیزی ناکافی و یا ناهمگون
  • خارج شدن DNA از ژل
  • نفوذ و پخش شدن DNA در ژل
  • پوشیده شدن DNA توسط رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی

مشکل: اسمیر شدن باندها

دلایل احتمالی:

  • تجزیه شدن DNA توسط نوکلئازها
  • شرایط نا مناسب الکتروفورز
  • اثر GEL SHIFT
  • بارگزاری بیش از اندازه DNA
  • غلظت بالای نمک در نمونه
  • شکل­گیری نامناسب چاهک های ژل

مشکل:‌ الگوهای باند غیر معمول

دلایل احتمالی:  

  • قبل از باگیری DNA مارکر گرم نشد.
  • دناتوره شدن DNA
  • شرایط بارگیری متفاوت برای نمونه DNA و مارکر DNA
  • شرایط نا مناسب الکتروفورز
  • استفاده از درصد ناصحیح ژل و یا بافر
  • مهاجرت غیر معمول به دلیل توالی ها و یا ساختارهای مختلف DNA
  • اثر GEL SHIFT
  • غلظت بالای نمک در نمونه ها

مشکل:‌ باندهای منحنی شکل DNA

دلایل احتمالی:‌

  • ژل به طور کامل در بافر الکتروفورز قرار نگرفته است.
  • حجم نمونه ها کم می باشد.
  • شرایط عمل الکتروفورز نامناسب است.
  • حباب ها و یا ذرات بزرگی در چاهک های ژل و یا خود ژل موجود می باشند.

مشکل:‌ باقی ماندن DNA در ژل

دلایل احتمالی:

  • شکل گیری نا مناسب چاهک های ژل
  • بارگیری بیش از اندازه DNA
  • آلوده شدن نمونه DNA
  • اثر GEL SHIFT

مشکل:‌ تعیین مقدار غلظ

دلایل احتمالی:‌

  • شرایط بارگیری متفاوت بین مارکر DNA و نمونه ها
  • تعیین باند غلظ مارکر برای تعیین مقدار نمونه
  • استفاده از روش تعیین مقدار نامناسب
  • رنگ امیزی ناهمگون ژل و نیز رنگ شدن پس زمینه نیز می تواند بر نتایج تعیین مقدار ژل اثر بگذارد.
  • پوشیده شدن DNA توسط رنگ های مسیریابی

درباره ما

شرکت سلامت ژن پژوه در سال 1393 فعالیت خود را در زمینه فعالیت های بازرگانی و اقتصادی شامل: خرید ، فروش ، تهیه ، تولید و توزیع لوازم و تجهیزات آزمایشگاهی ، تحقیقاتی و مواد شیمیایی مجاز آغاز نموده است . این شرکت با هدف ارتقای سطح علمی و پیشرفت علم وتکنولوژی در دانشگاه ها ، موسسات علمی پژوهشی، پژوهشگا ه ها و پژوهشکده ها و .... ایجاد گردیده و شهرت خود را برپایه توانایی ارائه محصولات با کیفیت با قیمت های رقابتی و بهترین سرویس و خدمات پس از فروش، بناداشته واین افتخار را دارد که به شعارخود (In our business customer is the king) تا حد توان متعهد باشد .

موقعیت ما

تماس با ما

  • تهران، یوسف آباد، خیابان جهان آرا، كوچه ٤٧،پلاك ١٧، واحد 5
  • 88067785 & 021-88067861
  • 021-88053320
  • info@healthgenelab.com
  • www.healthgenelab.com
  • 09389547502